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熒光偏振:生命科學研究領域的新寵兒

日期:2022-07-20 12:36
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摘要:

               熒光偏振:生命科學研究領域的新寵兒


   熒光偏振。近年來,以這種物理學現象為基礎的技術正悄悄地在生命科學研究的多個領域中扮演著越來越重要的角色。
    以熒光偏振為基礎發展的技術可用來研究生命科學中分子之間的相互作用,以及分子與所處環境——“至核酸和蛋白結構,至整個細胞——的相互作用。相對于傳統研究方法,熒光偏振技術在溶液中進行,可*大程度的模擬真實生命環境;利用它,可以實時跟蹤監測分子間結合/分離的變化,并解決一直以來困擾熒光技術使用者們對于熒光無法定量的煩惱。*為重要的是,相對于一直被人們使用的放射性同位素研究方法,它更為安全可靠,不會在實驗過程中對研究者造成威脅,也不會產生難以處理的具有放射性的廢棄物。此外,熒光偏振所需的樣品量少,靈敏度高,重復性好,操作簡便。

理論基礎
  談起熒光偏振,可能需要從偏振光開始。光由微小的波構成,光波可以在任何一個平面上均勻的振動。當其通過某些平面時,有可能因受到平面的作用將光波的能量分成不均勻的光束,振動平面也就發生了變化,可能在某一個方向的振動強或弱于其他平面,這種光稱為偏振光?;瘜W研究中常用到偏振光理論,這是因為偏振光在通過含有某種分子的溶液時,其振動性質將發生改變,如偏振平面受到扭轉,根據扭轉的方向和角度的變化,就能夠對溶液中分子的結構作出推斷?,F在,將偏振光和生物學研究者的得力助手熒光分子相結合形成的熒光偏振理論,正在生物學分支學科理論和應用研究中大顯身手。
  熒光偏振應用的基礎——“熒光偏振理論也是物理課上的老話題。1926Perrin**在研究論文中描述他所觀察到的熒光偏振現象。他發現,以一束單一波長的偏振光照射溶液中的熒光物質,后者可吸收并釋放出相應的偏振熒光。如果被激發的熒光物質處于靜止狀態,該物質仍將保持原有激發光的偏振性;如果其處于運動狀態,該物質發出的偏振光將區別于原有激發光的偏振特性,也就是所謂的熒光去偏振現象。
  眾所周知,任何物質都處于不斷運動當中,液態環境中的熒光分子也不例外。因此當受到偏振光激發時,熒光分子的運動狀態,例如旋轉或翻轉;熒光分子與其它因子的相互作用,例如相互結合或排斥;其所處環境的性質,例如溶液的粘度、溫度等,這些因素都有可能對這個熒光因子受激發后發出的偏振光的性質產生影響。對此進行分析比較,有可能揭開物質活動的內在規律,達到研究目的。
  因此,我們可以看到,以熒光偏振為基礎發展的技術可用來研究生命科學中分子之間的相互作用,以及分子與所處環境——“至核酸和蛋白結構,至整個細胞——的相互作用。相對于傳統研究方法,熒光偏振技術在溶液中進行,可*大程度的模擬真實生命環境;利用它,可以實時跟蹤監測分子間結合/分離的變化,并解決一直以來困擾熒光技術使用者們對于熒光無法定量的煩惱。*為重要的是,相對于一直被人們使用的放射性同位素研究方法,它更為安全可靠,不會在實驗過程中對研究者造成威脅,也不會產生難以處理的具有放射性的廢棄物。此外,熒光偏振所需的樣品量少,靈敏度高,重復性好,操作簡便。在以下的應用介紹中,讀者將會看到這項技術優越性的顯著體現。
 
  應用概述臨床應用方面
  熒光偏振**技術(Fluorescence Polarization Immunassay——這是一項相對較為成熟的技術。它利用熒光偏振原理,采用競爭結合法機制,常用來監測小分子物質如**、**在樣本中的含量。以**檢測為例,以熒光素標記的**和含待測**的樣本為抗原,與一定量的抗體進行競爭性結合。熒光標記的**在環境中旋轉時,偏振熒光的強度與其受激發時分子轉動的速度成反比。大分子物質旋轉慢,發出的偏振熒光強;小分子物質旋轉快,其偏振熒光弱(去偏振現象)。因此,在競爭性結合過程中,樣本中待測**越多,與抗體結合的標志抗原就越少,抗原抗體復合物體積越大,旋轉速率越慢,從而激發的熒光偏振光度也就越少。當我們知道了已知濃度的標記抗原與熒光偏振光性的關系后就可以測量未知濃度的物質。因此,這項技術可用來檢測環境或食品樣品中有毒物質如農藥的殘留量。
  此外,臨床醫學診斷也在廣泛采用熒光偏振。除應用上述方法可測定人體體液樣本中某一特定物質的含量外,也可直接應用于臨床診斷。例如,由Cercek等開發的惡性腫瘤診斷方法中提出,進入**細胞的熒光物質,受胞漿濃度有序性的干擾,其運動方向和速率會發生變化。胞漿粘度高時,熒光物質運動變慢,受偏振光激發產生的激發光與胞漿粘度低時產生的激發光性質不同。通過追蹤測定激發的偏振光性質,即可了解**細胞的胞漿流動性、粘度等環境的變化,結合其它輔助診斷方法,可有助于癌癥的早期診斷。利用熒光偏振,還可檢測病人樣本中病毒DNAHBV、HPV的復制量,為臨床診斷提供有力的量化指標依據。
 
科研方面
  從熒光偏振的理論基礎可以看出,它特別適用于研究分子之間的相互作用關系,因此,越來越多的研究者開始尋找以熒光偏振為基礎的研究方法來解決技術難題。目前,熒光偏振在生物學研究的應用主要有以下幾個方面:
 
核酸結構變化研究
  利用熒光偏振可幫助揭開DNA結構和結合蛋白之間的作用關系。以2003Nucleic Acids Research發表的一篇文章為例:DNA的復制、重組、修復,RNA的轉錄、翻譯和后處理等過程都涉及到核酸單鏈、雙鏈結構的變化。解旋酶(Helicase)是雙鏈DNA解鏈的動力蛋白,它以單向運動在DNA雙鏈上變換位置和核苷酸相結合,通過DNA上核苷5’三磷酸獲得ATP能量水解雙鏈DNA配對堿基間的H鍵。研究發現,以熒光標記寡核苷酸,后者可高度自由旋轉,因此受到偏振光的激發后發出的激發光偏振性很低。解旋酶-寡核苷酸復合物分子量大,旋轉速度低,激發光的偏振性高。隨著復合物的解體,高的偏振信號急劇減弱。因此,這種方法可結合動力學研究,通過偏振信號的變化對DNA雙鏈形成和解鏈過程進行實時監測,靈敏度高,方便迅速。此外,這種方法也應用于其它蛋白與DNA結合的研究中。
 
蛋白激酶活性研究
  人體細胞內的蛋白激酶可以對細胞外調節因子和環境變化做出反應,使細胞活化、生長和分化,轉錄調節、**應答等的重要調節因子。人們普遍認為蛋白激酶的錯誤表達和功能發揮失常是造**類多種**的原因。因此,長期以來,研究者致力于蛋白激酶結構和作用機理的研究,生物制藥業更是將蛋白激酶和蛋白激酶抑制劑作為小分子**研究的熱點。
  Panvera開發了一種基于熒光偏振的蛋白激酶活性試劑盒,可方便快捷的進行蛋白激酶抑制因子和篩選工作。其工作原理如下:將磷酸化底物進行熒光標記,與由蛋白激酶產生的未標記磷酸化產物抗絲氨酸抗體相競爭結合。當反應液中沒有蛋白激酶產生的磷酸化產物時,熒光標記物與抗體相結合,因復合物體積較大,運動速率較小,受偏振光激發后產生的激發光具有較大的偏振值;當反應液中含有蛋白激酶產生的磷酸化產物時,因二者競爭抗體的結合位點,較少的熒光標記物結合到抗體上去,自由的熒光標記物在反應液中增多,發出的激發光偏振值減小。因為蛋白激酶的活性越大,產生的磷酸化產物越多,與熒光標記物的競爭越激烈,對標記物產生的激發光的性質影響越大,因此偏振的改變直接與蛋白激酶的活性相關。這種分析簡單,易于應用,可很好的適用于高通量的篩選工作。
 
SNPs篩選
  SNPs是指人類基因組中普遍存在的個體之間相互區別的堿基變化位點,稱作單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphisms)。人們普遍認為,SNPs是人類個體之間相互區別的原因,也和多種**發生、變化相聯系。長期以來,SNPs位點的快速篩選需要大量的基因分型工作,花費巨大,是工作進展的*大障礙?,F在,研究者可以采用熒光偏振為基礎的FP-TDI技術(fluorescence polarization template-directed dye-terminator incorporation)進行高通量單核苷酸多態分型,操作簡單,投入少。
  實驗過程中先通過PCR獲得含有SNP位點的一條擴增產物,針對這條含有SNP興趣位點的序列設計一條寡核苷酸探針,在DNA聚合酶和熒光標記的ddNTP存在下,探針單堿基延伸。特定的ddNTP將結合到靶序列的SNP位點,并造成延伸反應的終止。自由的標記有熒光的ddNTP比結合到靶序列的ddNTP體積小,在液體環境中旋轉速度快,激發的偏振光的偏振值也小,而后者當ddNTP加到序列上后,有效分子體積變大,受偏振光激發后發出的偏振值高。因此,熒光偏振現象可以應用在鑒別ddNTP的結合位點和基因分型。
  目前,熒光偏振技術在生命科學研究領域的應用并不局限于以上幾個方面,以熒光偏振為基礎已經衍生出多項相關技術。受篇幅所限,本文只是將熒光偏振在目前研究領域中熱門方向中的應用和原理作了一個簡單的介紹。相信隨著學科間的不斷交叉、融合和這項技術的優化與推廣,它將受到研究者越來越廣泛的關注,在更多的研究領域發揮其重要作用。

 

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