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顯微鏡技術原理

日期:2022-07-20 12:36
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摘要:

顯微鏡技術

 

技術原理

 

微生物個體微小,用肉眼直接觀察不到,必須借助顯微鏡才能觀察到他的個體形態和細胞結構。在蛋白質結構等所需對物質的微觀結構進行觀察的研究中也都會用到各種顯微鏡。

現有的各種顯微鏡基本上都是由物鏡和目鏡組成,目鏡的焦距很短,目鏡的焦距很長,目鏡的作用是得到物體放大的實像,目鏡的作用是將物鏡放大的實像作為物體,進一步放大成虛像。顯微鏡將物體放大的總倍數是物鏡放大倍數乘以目鏡放大的倍數。這樣雖然目鏡和物鏡放大的倍數有限,但是顯微鏡總放大倍數就非??捎^。

 

儀器結構和分類

 

普通光學顯微鏡是一種精密的光學儀器。早期的顯微物鏡僅由少數幾塊透鏡組成,難于消除物像的像差和色差。近代的顯微物鏡已由一套精密磨制的透鏡組成,已能較好地消除像差和色差,并能將物體放大1500~2000倍。

普通光學顯微鏡的構造可分為兩大部分:即機械裝置和光學系統。這兩部分很好地配合,才能充分發揮顯微鏡的作用。

1.顯微鏡的機械裝置

    顯微鏡的機械裝置包括鏡座、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺、推動器、粗動螺旋和微動螺旋等部件。

    (1)鏡座  鏡座是顯微鏡的基本支架,由底座和鏡臂兩部分組成。在其上部連接有載物臺和鏡筒,是用于安裝光學放大系統部件的基礎。

    (2)鏡筒  鏡筒上接接目鏡,下接轉換器。形成接目鏡與接物鏡(裝在轉換器下)間的暗室。

從鏡筒的上緣到物鏡轉換器螺旋口之間的距離稱為機械筒長。因為物鏡的放大率是對一定的鏡筒長度而言的。鏡筒長度的變化,不僅放大倍率隨之變化,而且成像質量也受到影響。因此,使用顯微鏡時,不能任意改變鏡筒長度。國際上將顯微鏡的標準筒長定為160mm,此數字標在物鏡的外殼上。

(3)物鏡轉換器  物鏡轉換器上可安裝3~4個物鏡,一般是3個物鏡(低倍、高倍、油鏡),NIKON顯微鏡裝有4個物鏡。轉動轉換器,可以按需要

將其中的任何一個接物鏡和鏡筒接通,與鏡筒上面的目鏡構成一個放大系統。

    (4)載物臺  載物臺中央有一孔,為光線通路。在臺上裝有彈簧標本夾和推動器。

    (5)推動器  是移動標本的機械裝置,由一橫一縱兩個推進齒軸和齒條構成。研究顯微鏡的縱橫架桿上刻有刻度標尺,構成精密的平面坐標系。如需要重復觀察已檢查標本的某一物像時,可在**次檢查時記下縱橫標尺的數值,下次按數值移動推動器,就可以找到原來標本的位置。

    (6)粗調螺旋  粗調螺旋用于粗放調節物鏡和標本的距離,老式顯微鏡粗調螺旋向前扭,鏡頭下降接近標本。新近出產的顯微鏡(如Nikon顯微鏡)鏡檢時,右手向前扭動使載物臺上升,讓標本接近物鏡,反之則下降,標本遠離物鏡。

    (7)微調螺旋  用粗調螺旋只能粗放地調節焦距,難于觀察到清晰的物像,因而需要用微調螺旋做進一步調節。微調螺旋每轉一圈鏡筒僅移動0.1 mm(100μm)。新近出產的研究顯微鏡的粗調螺旋和微調螺旋是共軸的。

2.顯微鏡的光學系統

顯微鏡的光學系統由反光鏡,聚光器,物鏡,目鏡等組成,光學系統使標本物像放大,形成倒立的放大物像。

    (1)反光鏡  早期的普通光學顯微鏡常用自然光檢視標本,在鏡座上裝有反光鏡。反光鏡是由一平面和另一凹面的鏡子組成,可以將投射在它上面的光線反射到聚光器透鏡的中央,照明標本。不用聚光器時用凹面鏡也能起匯聚光線的作用。用聚光器時,一般都用平面鏡。新近出產的研究顯微鏡鏡座上裝有光源,并有電流調節螺旋,可通過調節電流大小來調節光照強度。

(2)聚光器  聚光器在載物臺下面。一般由聚光透鏡、虹彩光圈和升降螺旋組成。聚光器可分為明視場聚光器和暗視場聚光器。普通光學顯微鏡配置的都是明視場聚光器,明視場聚光器有阿貝聚光器、齊明聚光器和搖出聚光器。阿貝聚光器在物鏡數值孔徑高于0.6時會顯示出色差和球差。齊明聚光器對色差、球差和慧差的校正程度較高,是明視場鏡檢中質量*好的聚光器,但它不適于4倍以下的物鏡。搖出聚光器能將聚光器上透鏡從光路中搖出滿足低倍物鏡(4×)大視場照明的需要。

聚光器安裝在載物臺下,其作用是將光源經反光鏡反射來的光線聚焦于樣品上,以得到*強的照明,使物像獲得明亮清晰的效果。聚光器在光學系統中的位置可以通過其上的兩個調節螺桿將光圈調小后進行聚中調節。其高低也可以調節,使焦點落在被檢物體上,以得到*大亮度。一般聚光器的焦點在其上方1.25mm處,而其上升限度為載物臺平面下方0.1mm。因此,要求使用的載玻片厚度應在0.8~1.2mm之間,否則被檢樣品不在焦點上,影響鏡檢效果。聚光器前透鏡組前面還裝有虹彩光圈,它可以開大和縮小,影響成像的分辨力和反差,若將虹彩光圈開放過大,超過物鏡的數值孔徑時,便產生光斑;若收縮虹彩光圈過小,雖反差增大,但分辨力下降。因此,在觀察時一般應將虹彩光圈調節開啟到視場周緣的外切處,使不在視場內的物體得不到任何光線的照明,以避免散射光的干擾。

(3)物鏡  安裝在鏡筒前端轉換器上的物鏡利用入射光線時被檢物像進行**次造像,物鏡成像的質量對分辨力有著決定性的影響。物鏡的性能取決于物鏡的數值孔徑(numerical apeature簡寫為NA),每個物鏡的數值孔徑都標在物鏡的外殼上,數值孔徑越大,物鏡的性能越好。

    物鏡的種類很多,可從不同角度來分類:

    根據物鏡前透鏡與被檢物體之間的介質不同,可分為:

    1)干燥系物鏡  以空氣為介質,如常用的40×以下的物鏡,數值孔徑均小于1。

    2)油浸系物鏡  常以香柏油為介質,此物鏡又叫油鏡頭,其放大率為90×~100×,數值孔值大于1。

    根據物鏡放大率的高低,可分為:

    1)低倍物鏡  指1×~6×,NA值為0.04~0.15;

    2)中倍物鏡  指6×~25×,NA值為0.15~0.40;

    3)高倍物鏡  指25×~63×,NA值為0.35~0.95;

    4)油浸物鏡  指90×~100×,NA值為1.25~1.40。

    根據物鏡對像差和色差校正的程度來分類,可分為:

    1)消色差物鏡  是*常用的物鏡,外殼上標有"Ach"字樣,該物鏡可消除紅光和青光形成的色差。鏡檢時通常與惠更斯目鏡(Huygens eyepiece)配合使用。

    2)復消色差物鏡  物鏡外殼上標有“Apo”字樣,除能校正紅、藍、綠三色光的色差外,還能校正黃色光造成的像差,通常與補償目鏡配合使用。

    3)特種物鏡  在上述物鏡基礎上,為達到某些特定觀察效果而制造的物鏡。如帶校正環物鏡、帶視場光闌的物鏡、相差物鏡、熒光物鏡、無應變物鏡、無罩物鏡、長工作距離物鏡等。目前研究顯微鏡常用的物鏡還有:半復消色差物鏡(semi-APO)、平場物鏡(Plan)、平場復消色差物鏡(Plan Apo)、超平場物鏡(Splan)、超平場復消色差物鏡(Splan Apo)等。    、

    (4)目鏡  目鏡的作用是把物鏡放大了的實像進行**次放大,并把物像映入觀察者的眼中。目鏡的結構較物鏡簡單,普通光學顯微鏡的目鏡通常由兩組透鏡組成,上端的一組透鏡又稱為“接目鏡”,下端的則稱為“場鏡”。上下透鏡之間或在兩組透鏡的下方,裝有由金屬制的環狀光闌或叫“視場光闌”,物鏡放大后的中間像就落在視場光闌平面處,所以其上可安置目鏡測微尺。

普通光學顯微鏡常用的目鏡主要是惠更斯目鏡,研究顯微鏡配有性能更好的目鏡,如補償目鏡(K)、平場目鏡(P)和廣視場目鏡(WF)等。照相時選用照相目鏡(NFK)。

 

顯微鏡根據照明方法分類,有透射型與反射(落射)型二種。透射型顯微鏡是應用透射照明通過透明物體的打光方法。反射型顯微鏡是以物鏡上方打光到(落射照明)不透明的物體上。

顯微鏡根據觀察方法的差異分類,分為明視野顯微鏡、暗視野顯微鏡、相位差顯微鏡、偏光顯微鏡、干涉相位差顯微鏡、熒光顯微鏡等。每種顯微鏡一般又各有透射型和反射型二種。在這些顯微鏡中,特別是明視野顯微鏡是構成所有顯微鏡中組成*基本的基礎。通過這種顯微鏡觀察的物體,穿過透過(吸收)率、反射率,因場所不同而各不相同,這種物體被稱為隨照明光強度(振幅)變化振幅物體,無色透明物體只有在照明相位改變時,才能被肉眼觀察到,由于明視野顯微鏡不能改變相位,所以對透明不染色標本不能被觀察到。

顯微鏡根據成像原理不同,可以分為光學顯微鏡(OM)、透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)、高壓電子顯微鏡(HVEM)、分析電子顯微鏡(AEM)、場離子顯微鏡(FIM)、場發射電子顯微鏡(FEEM)、聲學顯微鏡(AM)、掃描隧道顯微鏡(STM)和原子力顯微鏡(AFM)等。

 

儀器操作規程

 

1. 以YS2-H顯微鏡為例介紹光學顯微鏡的使用方法

觀察前的準備

顯微鏡從顯微鏡柜或鏡箱內拿出時,要用右手緊握鏡臂,左手托住鏡座,平穩地將顯微鏡搬運到實驗桌上。

    將顯微鏡放在自己身體的左前方,離桌子邊緣約lOcm左右,右側可放記錄本或繪圖紙。

    調節光照。對于不帶光源的顯微鏡,可利用燈光或自然光通過反光鏡來調節光照,但不能用直射陽光,直射陽光會影響物像的清晰并刺激眼睛。將10×物鏡轉入通光孔,將聚光器上的虹彩光圈打開到*大位置,用左眼觀察目鏡中視野的亮度,轉動反光鏡,使視野的光照達到*明亮*均勻為止。光線較強時,用平面反光鏡,光線較弱時,用凹面反光鏡。對于自帶光源的顯微鏡,可通過調節電阻旋鈕來調節光照強弱。

 

光軸中心調節。顯微鏡在觀察時,其光學系統中的光源、聚光器、物鏡和目鏡的光軸及光闌的中心必須跟顯微鏡的光軸同在一直線上。使用帶視場光闌的顯微鏡時,先將光闌縮小,用10×物鏡觀察,在視場內可見到視場光闌球形多邊形的物像。如此像不在視場中央,可利用聚光器外側的兩個調整旋鈕將其調到中央,然后緩慢地將視場光闌打開,能看到光束向視場周緣均勻展開直至視場光闌的多邊形物像完全與視場邊緣內接,說明光線已經合軸。

低倍鏡觀察

    鏡檢任何標本都要先用低倍鏡觀察,低倍鏡視野較廣,易于發現目標和確定檢查的位置。

    將標本片放置在載物臺上,用標本夾夾住,移動推動器,使被觀察的標本在物鏡正下方,轉動粗調節旋鈕,使物鏡調至接近標本處,用目鏡觀察并同時粗調節旋鈕慢慢升起載物臺(或下降鏡筒),直至物像出現,再用細調節旋鈕物像清晰為止。用推動器移動標本片,找到合適的標本物像并將它移到視野中進行觀察。

高倍鏡觀察  

    在低倍物鏡觀察的基礎上轉換高倍物鏡?,F在常用的顯微鏡,低倍、高倍物鏡同焦的,在正常情況下,高倍物鏡的轉換不應碰到載玻片或其上的蓋玻片。若使用不同型號的物鏡,在轉換物鏡時要從側面觀察,避免鏡頭與玻片相撞。然后目鏡觀察,調節光照,使亮度適中,緩慢調節粗調節旋鈕,使載物臺上升(鏡筒下降),直至物像出現,再用細調節旋鈕調至物像清晰為止,找到需觀察的部位.并移至視野中央進行觀察。

油鏡觀察

    油浸物鏡的工作距離(指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離)很短,一般在O.2 mm以內,再加上一些光學顯微鏡的油浸物鏡沒有“彈簧裝置”,因此使用油浸物鏡時要特別細心,避免由于“調焦”不慎而壓碎標本片并使物鏡受損。

使用油鏡按下列步驟操作:

先用粗調節旋鈕將載物臺下降(或將鏡筒提升)約2cm,并將高倍鏡轉出。

在玻片標本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。

從側面注視,用粗調節旋鈕將載物臺緩緩地上升,(或鏡筒下降),使油浸物鏡浸入香柏油中,使鏡頭幾乎與標本接觸。

    從接目鏡內觀察,放大視場光闌及聚光器上的虹彩光圈(帶視場光闌油鏡開大視場光闌),上調聚光器至頂位,使光線充分照明。用粗調節旋鈕將載物臺徐徐下降(或鏡筒上升),當出現物像一閃后改用細調節旋鈕調至*清晰為止。如油鏡已離開油面而仍未見到物像,必須再從側面觀察,重復上述操作。

觀察完畢,下降載物臺,將油鏡頭轉出,先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油,再用擦鏡紙蘸少許乙醚乙醇混合液(乙醚2份,無水乙醇3份)或二甲苯,擦去鏡頭上殘留油跡,*后再用擦鏡紙擦拭2~3下即可(注意朝一個方向擦拭)。   

將各部分還原,轉動物鏡轉換器,使低倍物鏡與載物臺通光孔相對,再將載物臺下降至*低,降下聚光器,反光鏡與聚光器垂直,用一個干凈罩子將接目鏡罩好,以免目鏡頭沾污灰塵。*后用柔軟紗布清潔載物臺等機械部分,然后將顯微鏡放回柜內或鏡箱中。

2. JSZ連續變倍體視顯微鏡使用方法

燈光照明:上電源插頭。打開開關直到獲得所需亮度。照明亮度取決于各種條件,如:眼睛適應能力等。太弱或太強都不適宜,一般情況下,不要將照明亮度調到*高強狀態,否則會使燈泡在滿載負荷下工作,從而縮短燈泡壽命。

調焦:將被觀察物置于工作臺中間,根據物體大小調支架與桿連接固定手輪距離,不加大物鏡97mm,加大物鏡50mm。后調調焦手輪,直到看清晰物象為止。調焦手輪松緊緊,由兩手輪反向旋轉而定,可自調、直到松緊舒適為止。

瞳距:為使雙目觀察視物相重合,可調節目鏡筒和您瞳距相同。

視度調節:以左眼為基準,調節調焦手輪直到看清左筒像為止,右眼對右筒調節視度調節環,直到看清像為止,這樣可消除您兩眼視差,在您眼前將出現高質量三維圖像。

變倍:調節變倍手輪刻度0.7~3,得您所得放大倍率,讀數為:目鏡倍數×變倍手輪刻度×大物鏡倍數。

3. XSZ-H雙目生物顯微鏡使用方法

將電源插頭插入外接電源插座(插入前應檢查外接電源電壓與輸入電源電壓是否相符)。

先將亮度調節柄調至*小位置,開啟電源開關,滑動亮度調節柄至適中位置。

轉動物鏡轉換器,將10×物鏡置入光路。

轉動聚光鏡升降手輪,使聚光鏡上升至定位位置。

標本置于載物臺上,用片夾固定,并借助于載物臺縱橫移動手輪,使觀察物進入聚光鏡的照明區域內。

撥動光欄撥桿,將孔徑光欄開至中間位置。

用右眼觀察,調焦使物像清晰(可轉動粗調手輪使載物臺緩緩上升至見物像輪廓,再用微調手輪精細調焦到物象清晰)。調滾花螺釘,使目鏡鏡場內視場光欄像居中(轉動視場光欄轉圈,可改變視場光樣大?。?。

瞳距及視度調節,用左目鏡觀察,并轉動雙目左目鏡筒上的視度調節圈,使之成像清晰。雙手握雙目外殼轉動,使兩目鏡出瞳中心距適合你的兩眼瞳距,兩眼圖象合一為止。通過此兩項調整,便可滿足你的瞳距和視度要求。

4. XDS-1型倒置生物顯微鏡使用方法

將亮度調節柄調至*小位置,接通開關,再將亮度調節手柄調至適中位置。

將標本置于載物臺上,使用低位同軸手輪可方便地操縱載物臺作X、Y方向移動,并可從刻尺和游標定出觀察目標的位置。載物臺上可安裝不同的載物片,試管壓片等,以適應不同的使用場合。

手握轉換器外緣轉動轉換器,將低倍物鏡置入光路,通過目鏡觀察,使用粗微調焦手輪使標本成像清晰(當手輪向箭頭所示方向旋轉時,轉換器向上運動)。

將高倍物鏡置入光路,用右目鏡觀察,調整微動手輪使成像清晰。用左目鏡觀察,調整視度調節圈使成像清晰。

雙手握左右目鏡筒相對轉動,可在55-77mm范圍內調整雙目瞳距與觀察者瞳距一致(雙像重合)。

換用所需倍數的物鏡,對XDS-1型,插入活動聚光鏡片,撥動視場光欄撥桿將視場光欄關??;調整聚光鏡升降手輪,使視場光欄成像清晰;調整聚光鏡調節螺釘,使視場光欄像與目鏡視場光欄同心,并將現場光欄打開至其像在視場中剛好消失為止。

取下目鏡直接從目鏡筒中觀察,用孔徑光欄撥桿調整孔徑光欄大小,使其像充滿物鏡出瞳(后光孔)的80%左右,便能獲得較好的襯度。通常更換物鏡時都應作此項調整。

調整并列的三個燈源調節手柄,使燈絲成像于孔徑光欄正中(可臨時放一白色紙片在聚光鏡保護玻璃上觀察)。

濾色片轉盤中已裝入各種顏色濾色片,轉動轉盤到定位位置,則轉盤側面標記色的濾色片已進入光路。

使用XDS-1A型時,應將選用的濾色片裝入濾色片插座

相襯觀察

將環板片插入聚光鏡相應插孔中。

孔徑光欄開至*大

相應放大倍數的相襯物鏡置入光路。

在一個目鏡筒中換用對中目鏡觀察,調節對中目鏡的視度調節圈,并稍調節聚光鏡升降手輪,使環板上的亮圈和相板上的暗環成像同時清晰。

轉動環板座調節螺釘,使環板和相板的中心重合。

取下對中目鏡,換上廣角目鏡,即可進行相襯觀察。

攝影及攝像

膠卷裝入相機背板內,裝上快門線,將攝影拉桿拉出到定位位置,放下相機里的反光鏡,取景器中便能看到標本像。

10X分劃目鏡插入目鏡筒內,調整分劃目鏡視度圈及粗微動調焦手輪,使分劃板與標本同時成像清晰。

選擇適當亮度和曝光時間,將相機中的反光鏡提起,即可按下快門拍攝。

攝像:旋下相機接口,換上C型標準接頭,再聯接好攝像頭,按攝錄像裝置的說明書安裝好攝錄像系統。將攝影拉桿拉出到定位位置時,監視器上便會出現從目鏡中所見的圖像。

更換攝影或攝像目鏡:為增加攝影或攝像倍率,可用選購的S6.3X攝影目鏡取代已裝入儀器主體中的S5X攝像目鏡,方法是旋松滾花緊定螺釘,取下攝影接筒,撥出接座內的攝影目鏡,換上所需攝影目鏡即可。

攝像時,若需將視場中的圖像全部攝入,可按上述方法換上S0.65X攝像目鏡。

粗動松緊調節及限位:轉動松緊調節手輪,可調整粗動手輪的松緊;限位手輪可以限定物鏡轉換器上升的*高位置,以便快速準焦。

更換燈泡:切斷電源,松開不脫出螺釘,取出燈座,向上輕輕地拔出燈泡,再將新的燈泡小心插入即可。

更換保險絲:切斷電源,旋下保險絲盒蓋,即可更換保險絲。

5. 熒光顯微鏡

    普通光學顯微術是利用可見光使鏡下標本得到照明,通過物鏡和目鏡系統放大以供觀察。所以,我們看到的是標本的直接的本色,這里光源所起的作用僅僅是照明。熒光顯微術是利用一定波長的光使鏡下標本受激發產生熒光,通過物鏡和目鏡系統放大以供觀察,所以我們看到的不是標本的本色,而是它的熒光。這里光源所起的作用不是直接照明,而是作為一種激發光。由此可知熒光顯微鏡的特點主要在于它的光源,即這種光源必須能供給特定波長范圍的光,使受檢標本的熒光物質得到必要程度的激發。

    熒光顯微鏡多利用紫外光和短波光作光源,照射被檢物后,使其激發出可見熒光。按照熒光光源位置的不同,熒光顯微鏡分為透射式和落射式兩種。

熒光顯微鏡的光源一般為高壓汞燈,燈泡是用石英玻璃制成的,發出的強光于激發熒光色素。儀器所用激發色素和吸收激發光的濾色鏡,由研究者根據實驗研究要求及顯微鏡類型進行選配。

熒光顯微鏡詳細使用和操作方法見http://swzx.jlu.edu.cn

 

注意事項

 

1. 儀器應在陰涼、干燥、無塵、防震、無酸堿蒸汽的環境里使用。

2. 儀器出廠時均經嚴格校正,不得自行拆御。

3. 使用和搬運時,動作要輕,避免強烈振動和碰撞。

4. 外露鏡片表面不得用手觸摸,其上的灰塵污物可用洗耳球或柔軟毛刷去除,必要時可用清潔軟布沾少許二甲苯或酒精乙醚(3:7)混合液擦試。

5. 外接電源必須有接地線。

6. 使用高倍物鏡時,標本的蓋玻片厚度應滿足設計要求的0.17mm,誤差不大于±0.01mm,否則影響圖像清晰度。

7. 不得在載物臺上放置過重物體,以防載物臺變形。

8. 儀器不工作時應切斷電源,罩好防塵罩。停用時間較長時,*好將物鏡、目鏡、雙筒目鏡組、照像機等從主機上取下放入干燥器中,同時在主機上蓋上相應的防塵蓋,再用防塵罩罩好。

 

思考題

 

1. 物鏡的種類各具有何種特點?

2. 顯微鏡的放大率和分辨率之間有何區別和聯系?

3. 使用普通光學顯微鏡觀察透明物體時應采取何種措施?

4. 使用光系物鏡時,將物鏡浸到顯微鏡用油中是否可以?

5. 體視顯微鏡和普通光學顯微鏡有何不同之處?

6. 熒光顯微鏡和普通光學顯微鏡有何不同之處?

粵公網安備 44030902000337號

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